本文采用微波酸水解和微波酶水解的方法，建立了一套检测腐败生物组织中吗啡的方法。与传统的水浴加热水解相比较，微波水解大大缩短了水解时间，能够使吗啡与蛋白充分解离。该方法具有快速，灵敏度、精确度和准确度高的特点，适合大批量腐败生物检材的标准化分析测定，并成功应用于一些案例的检测工作，取得了良好的效果。
［关键词］  微波酸水解  微波酶水解  腐败生物组织  吗啡

1  前言
        海洛因是当今国际上吸、贩毒中最为常见的毒品之一。近几年来，我国吸食海洛因导致的中毒死亡案件逐年增多，国内外对于这类死亡者体液中的海洛因及其代谢产物吗啡的检测以及其在体内的分布研究已有很多的报道。但是对于腐败生物组织中吗啡的检测却报道甚少，并且在实际检验中，此类案件检材中毒品成分含量少、杂质干扰大、回收率低，检验存在很大的难度。本文将微波技术应用于腐败生物组织中毒品成分吗啡的检验研究，取得了预期的效果。

2  实验部分
2.1  仪器与试剂
    CEM生产的MARS 5微波控制系统，配备14个高压微波罐，最高温度260℃，最大压力500psig；
岛津QP-5050A 气质联用仪，J＆W DB-5MS(30m×0.25mm×0.25um)毛细柱；
PE AutoSystem XL气相色谱仪，J＆W DB-5MS(30m×0.25mm×0.25um)毛细柱，NPD检测器。
标准样品溶液：取吗啡、氘代吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因、海洛因等纯品，分别用无水乙醇配成1mg/ml的标准样品溶液。
    缓冲液：分别配制PH为3，5，7，9的缓冲液。
衍生化试剂：MSTFA［N-甲基-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺］，置于密封瓶中，贮于4℃的冰箱内备用。
酶制剂：复合风味蛋白酶，置于密封瓶中，贮于4℃的冰箱内备用。
溶剂：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、异丙醇等均为分析纯；用去离子水分别配制2M、4M、6MHCL溶液。
固相柱：HLB、MCX（购自WATERS公司，规格300mg/3ml）。
2.2  仪器操作条件
2.2.1  微波操作条件
微波酸水解条件：5分钟内升温至120℃，保持15分钟。
微波酶水解条件： 5分钟内升温至50℃，保持25分钟。
2.2.2  GC和GC/MS操作条件
GC条件：柱温230℃，保持1分钟，每分钟10℃升至280℃，保持10分钟；进样口温度260℃，检测器温度280℃，分流比为20：1。
GC/MS条件：柱温200℃，保持1分钟，每分钟20℃升至280℃，保持10分钟；进样口温度260℃，接口温度230℃；载气（氦气）压力128KPa；分流比为20：1； EI离子源，电子能量70eV，离子源温度180℃；扫描质量范围50～500amu。
2.3  分析步骤
2.3.1腐败生物组织的收集与制备
　　称取3克案件收缴海洛因（含量约为60%），溶于1000ml的新鲜牛奶中，一头约50公斤的小牛服用一小时后死亡。解剖提取牛肝组织置于大烧杯中，用塑料布封好，通风橱中自然腐败。三年后，取高度腐败的牛肝组织备检。
2.3.2  微波酸水解的步骤
　　准确称取1克检材肝组织，置于微波水解罐中，加入10ml 2M的HCl溶液，盖好密闭活塞，在微波控制系统中水解20分钟。
2.3.3  微波酶水解的步骤
　　准确称取1克检材肝组织，置于微波水解罐中，添加100mg复合风味蛋白酶，再加入10mlPH值为5的缓冲溶液，盖好密闭活塞，在微波控制系统中水解30分钟。
2.3.4  水浴加热酸水解的步骤
　　准确称取1克检材肝组织，置于三角烧瓶中，加入10ml 2M的HCl溶液，盖上表面皿于80℃水浴中加热水解4小时。
2.3.5  水浴加热酶水解的步骤
　　准确称取1克检材肝组织，置于三角烧瓶中，添加100mg复合风味蛋白酶，再加入10mlPH值为5的缓冲液，盖上表面皿于50℃水浴中加热水解4小时。
2.3.6  样品提取净化步骤
　　将上述水解后的溶液冷却至室温常压后转入离心试管内；加助滤剂后涡旋振荡1分钟；高速（8000转/分钟）离心30分钟；取上清液并调节PH值为8.7，备用。取HLB或MCX固相柱，用2ml甲醇淋洗活化后，再用2ml去离子水淋洗；取制备的样品溶液2ml过固相柱，分别用2ml甲醇和水洗涤除去杂质，再将固相柱吹氮气3分钟除去残留水分，然后用氯仿：异丙醇（9：1）或醇胺溶液2ml洗脱药物，收集的洗脱液在50℃下用氮气吹干。用50ul的乙酸乙酯溶解吹干的洗脱液残渣，加入衍生化试剂MSTFA，涡旋振荡2分钟后，于70℃下加热20分钟，取1ul进行GC/NPD或GC/MS分析。
3结果与讨论
3.1  微波酸水解酸度选择
　　分别准确称取1克检材肝组织，分别加入10ml 2M、4M、6M HCl溶液，设定微波水解条件：5分钟升温至120℃，保持15分钟，进行微波酸水解酸度试验，测定检材肝中的吗啡含量，结果详见图1。实验表明，2M HCl是最佳的水解酸度条件。

3.2  微波酸水解温度选择
　　分别准确称取1克检材肝组织，分别加入10ml 2M HCl溶液，设定微波水解条件：5分钟升温至80℃、100℃、120℃、140℃、160℃，保持15分钟，分别进行微波酸水解温度试验，测定检材肝中的吗啡含量，结果详见图2。实验表明，120℃是最佳的水解温度条件。

3.3  微波酸水解时间选择
　　分别准确称取1克检材肝组织，分别加入10ml 2M HCl溶液，设定微波水解条件：5分钟升温至120℃，分别保持5、10、15、20、25、35分钟，进行微波酸水解时间选择，测定检材肝中的吗啡含量，结果详见图3。实验表明，微波酸水解20分钟是最佳的水解时间条件。

3.4  微波酶水解PH值选择
　　分别准确称取1克检材肝组织，分别加入10mlpH为3、5、7、9的缓冲液和100mg复合风味蛋白酶，设定微波水解条件：5分钟升温至50℃，保持25分钟，进行微波酶水解酸度试验，测定检材肝中的吗啡含量，结果详见图4。实验表明，PH5为最佳的水解酸度条件。

3.5  微波酶水解温度选择
　　分别准确称取1克检材肝组织，分别加入10mlpH为5的缓冲液和100mg复合风味蛋白酶，设定微波水解条件：5分钟分别升温至30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，保持25分钟，分别进行微波酶水解温度试验，测定检材肝中的吗啡含量，结果详见图5。实验表明，50℃为最佳的水解温度条件。

3.6  微波酶水解时间选择
　　分别准确称取1克检材肝组织，分别加入10mlpH为5的缓冲液和100mg复合风味蛋白酶，设定微波水解条件：5分钟升温至50℃，分别保持10、15、20、25、30、35分钟，进行微波酶水解时间选择试验，测定检材肝中的吗啡含量，结果详见图6。实验表明，微波酶水解30分钟为最佳的水解时间条件。

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